氨基酸組分分析
如果目前分離蛋白質(zhì)組的技術(shù)是2-DE，那么隨之而來的挑戰(zhàn)是數(shù)百數(shù)千個蛋白如何被鑒定. 在這里，我們不考慮傳統(tǒng)的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內(nèi)肽的化學測序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個有機體中有意義的基因的過表達. 并不是因為這些方法無效，而是因為它們通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選. 目前，所選用的技術(shù)包括對于蛋白鑒定的圖象分析、微量測序；進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析.ELISA試劑盒
(1) 圖象分析技術(shù)(Image analysis).
“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失，都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生，必須依靠計算機為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理，進行定量分析. 在一系列高質(zhì)量的2-DE凝膠產(chǎn)生(低背景染色，高度的重復性)的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建. 首先，采集圖象通常所用的系統(tǒng)是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機；激光密度儀(laser densitometers)和Phospho或Fluoroimagers，對圖象進行數(shù)字化. 并成為以象素(pixels)為基礎(chǔ)的空間和網(wǎng)格. 其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測. 利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義的區(qū)域與背景分離，限定斑點的強度、面積、周長和方向.
圖象分析檢測的斑點須與肉眼觀測的斑點一致. 在這一原則下，多數(shù)系統(tǒng)以控制斑點的重心或zui高峰來分析，邊緣檢測的軟件可描述斑點外觀，并進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加度. 通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢復共遷移的斑點邊界. 以PC機為基礎(chǔ)的軟件Phoretix-2D正挑戰(zhàn)古老的Unix為基礎(chǔ)的2-D分析軟件包. 第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化. 由于在2-DE中出現(xiàn)100%的重復性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質(zhì)的配比對于圖象分析系統(tǒng)是一個挑戰(zhàn). IPG技術(shù)的出現(xiàn)已使斑點配比變得容易.
因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量算法在長度和平行度觀測. 用來配比的軟件系統(tǒng)包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被采用，而神經(jīng)網(wǎng)絡、子波變換和實用分析在未來可被采用. 配比通常由一個人操作，其手工設(shè)定大約50個突出的斑點作為“路標”，進行交叉配比. 之后，擴展至整個膠. 例如：的PI和MW(分子量)的估計通過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標準曲線來計算未知蛋白的PI和MW. 在凝膠圖象分析系統(tǒng)依據(jù)已知蛋白質(zhì)的pI值產(chǎn)生PI網(wǎng)絡，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配.
所估計的度大大依賴于所建網(wǎng)格的結(jié)構(gòu)及標本的類型. 已知的未被修飾的大蛋白應該作為標志，變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0.25個單位. 同理，已知蛋白的理論分子量可以從數(shù)據(jù)庫中計算，利用產(chǎn)生的表觀分子量的網(wǎng)格來估計蛋白的分子量. 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯后蛋白的出入更大. 故需聯(lián)合其他的技術(shù)完成鑒定. ELISA試劑盒
(2) 微量測序(microsequencing).
蛋白質(zhì)的微量測序已成為蛋白質(zhì)分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息. 盡管氨基酸組分分析和肽質(zhì)指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白，但zui普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術(shù). 目前已實現(xiàn)蛋白質(zhì)微量測序的自動化. 首先使經(jīng)凝膠分離的蛋白質(zhì)直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然后直接置于測序儀中，可用于subpicomole水平的蛋白質(zhì)的鑒定.
但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速率產(chǎn)生；與質(zhì)譜相比，Edman降解消耗大；試劑昂貴，每個氨基酸花費3～4$. 這都說明泛化的Edman降解蛋白質(zhì)不適合分析成百上千的蛋白質(zhì). 然而，如果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質(zhì)，或者如果其他技術(shù)無法測定而克隆其基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序.
近來，應用自動化的Edman降解可產(chǎn)生短的N-末端序列標簽，這是將質(zhì)譜的序列標簽概念用于Edman降解，業(yè)已成為一種強有力的蛋白質(zhì)鑒定. 當對Edman的硬件進行簡單改進，以迅速產(chǎn)生N-末端序列標簽達10～20個/d，序列檢簽將適于在較小的蛋白質(zhì)組中進行鑒定.若聯(lián)合其他的蛋白質(zhì)屬性，如氨基酸組分分析、肽質(zhì)質(zhì)量、表現(xiàn)蛋白質(zhì)分子量、等電點，可以更加可信地鑒定蛋白質(zhì). 選擇BLAST程序，可與數(shù)據(jù)庫相配比. 目前，采用一種Tagldent的檢索程序，還可以進行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質(zhì)組研究中的作用.ELISA試劑盒
上一篇 熒光原位雜交的染色體分析 下一篇 制備感受態(tài)細胞與轉(zhuǎn)化
